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lncRNA測序 | ALU序列的插入促使lncRNA反式調控基因的可變剪接
發布日期:2017-11-02瀏覽:
文章題目:Insertion of an Alu element in a lncRNA leads to primate-specific modulation of alternative splicing
中文譯名:ALU序列的插入促使lncRNA反式調控基因的可變剪接
合作單位:中國科技大學
發表時間:2016.10
發表雜志:Nature structural & biology
影響因子:13.338
應用方向:lncRNA
研究發現
1. 發現一個lncRNA--5S-OT(在真核生物中由5S rDNA轉錄得到)。
2。 lncRNA--5S-OT在小鼠和人中順式調控5S rRNA的轉錄。
3. 靈長類動物中反義的ALU序列被插入到5S-OT。
4。 在人類細胞中,5S-OT可以通過與靶基因Alu/anti-Alu序列配對以及與剪切因子U2AF65相互作用來反式調控多個基因的可變剪切。
 

研究結果展示
 
1. 哺乳動物中5S rRNA重疊轉錄本的鑒定
 
在小鼠和人類中,作者鑒定了一個lncRNA,與5S rRNA序列重疊(Fig. 1a),RT-PCR實驗顯示這個lncRNA是一個正義的轉錄本。另外,RACE, full-length RT–PCR 和 northern blots實驗顯示這個轉錄本在小鼠和人類中的長度分別是847 nt 和354 nt (Fig. 1b,c),稱為5S-OT。作者又通過一系列實驗發現5S-OT (1)存在于小鼠和人類的所有細胞和組織;(2)可能是由pol II合成的轉錄本,并帶有3’ poly(A)尾巴;(3)將pol II 抑制后導致5S-OT水平下降;ChIP顯示結合到啟動子上并在5S-OT的轉錄起始位點的第一個核小體附件形成peak;(4)5S-OT不能編碼蛋白。
 
 
2。 5S-OT順式調控5S rRNA的轉錄
 
抑制pol II 后可導致初期5S-OT和5S rRNA的生成減少(Fig。 1d),結果表明5S-OT對5S rRNA的轉錄有順式調控的作用。作者通過改變5S-OT的表達水平進一步研究其調控機制。siRNAs敲除5S-OT后導致初期5S rRNA生成減少(Fig。 1e),利用ASO敲除5S-OT,結果一致。ChIRP實驗顯示5S-OT結合到5S rRNA的啟動子上。以上結果表明5S-OT RNA可以與5S rDNA cluster的染色質結合,對促進5S rRNA 的轉錄有順式調控的作用(Fig。 1f)。
 
   
 
3. 人類的5S-OT調節可變剪切
 
作者利用siRNAs對5S-OT進行敲除并進行RNA測序,在HEK293T 和HeLa中有200多個外顯子發生顯著改變(Fig. 2a–c)。對發生顯著剪切變化的cassette exons進行定量,分別在293T 和 HeLa 細胞中發現102 和 146 個外顯子有增加的inclusion及142 和125 exons 增加的 exclusion,作者稱之為顯著變化的h5S-OT-sensitive exons。western blotting驗證顯示不同轉錄本亞型的蛋白水平的變化與其mRNA水平變化一致。
 
與可變剪切比較,基因表達量的改變并不是非常顯著的,在293T和HeLa細胞中分別有226和34個基因表達量發生顯著改變。在小鼠細胞N2a中,敲除m5S-OT后,有98個cassette exons的可變剪切發生顯著變化。另外,FISH實驗證實5S-OT位于細胞核內,并且不僅僅存在于5S rDNA的基因座上(Fig. 2d)。以上結果表明h5S-OT可反式調控多個基因的可變剪切過程。
 
 
4。 h5S-OT通過ALU配對調節可變剪切
 
h5S-OT是如何調控人類細胞中多個外顯子的可變剪切的呢?
 
作者在h5S-OT的3’端發現含有反義ALU序列 (Fig。 3a),是靈長目特有的轉座因子。生物信息學分析顯示90%以上帶有h5S-OT-sensitive exons的基因前體mRNA含有ALU序列。
 
作者對h5S-OT-sensitive exons 上下游內含子進行了研究,發現ALU數量與對照組外顯子相比沒有明顯差異(Fig. 3b)。
 
有趣的是,在敲除h5S-OT后,帶有increased inclusion的外顯子在其下游有更多的ALU序列,而帶有increased exclusion的外顯子在其上游有更多的ALU序列(Fig. 3c)。進一步分析顯示h5S-OT sensitive exons 5′或 3′端的2KB區域內有更多的機會擁有ALU序列,對這個區域進行檢測發現,在敲除h5S-OT后,帶有increased inclusion的外顯子在其下游有更多的ALU序列,而帶有increased exclusion的外顯子在其上游有更多的ALU序列(Fig. 3d,e)。
 
以上分析表明前體mRNA中ALU序列的分布與h5S-OT調節的外顯子的inclusion或exclusion有明確的聯系。
 
通過RNase-protection assays (RPAs)(Fig。 3f)發現h5S-OT在體外可以形成雙鏈RNA,而缺乏ALU的RNA則不能。RNA pulldown和ChIRP 實驗(Fig。3g,h,i)發現,8個h5S-OT-sensitive 基因的確與h5S-OT相互作用。以上結果表明h5S-OT通過與ALU配對調控可變剪切。
 
 
5. h5S-OT與U2AF65相互作用
 
h5S-OT對可變剪切的影響可能也受到蛋白的調節,因此作者進行pull downs實驗發現h5S-OT可與剪接因子U2AF65結合 (Fig. 4a)。通過RNA immunoprecipitation (RIP)進一步證實兩者確實相互作用(Fig. 4b,c)。在h5S-OT中含有polypyrimidine tract (Py)序列(由于ALU的插入所創建的),U2AF65可與Py結合,一系列驗證發現, h5S-OT中的Py 是U2AF65的結合位點(Fig. 4d)。因此,由于ALU的插入所創建的PY位點對于招募U2AF65是重要的。
 
 
6. U2AF65和Alu pairing對于h5S-OT的反式作用都是需要的
 
為研究U2AF65 參與h5S-OT反式調節機制,作者將U2AF65敲低并進行RNA測序,發現在HeLa 和293T中分別有835和750個外顯子被顯著改變(Fig。 5a),作者稱它們為U2AF65-sensitive exons。在HeLa和293T細胞中,分別有158和100個外顯子對U2AF65和h5S-OT均敏感 (Fig。 5b),生物信息學分析顯示這些外顯子在exclusion或inclusion的變化中呈正相關 (Fig。 5c)。對U2AF65過表達并不能抵消因h5S-OT敲低所導致的可變剪切的影響,說明h5S-OT主要影響U2AF65的分布而非蛋白水平。h5S-OT 敲低后, 與h5S-OT-sensitive基因結合的U2AF65減少(Fig。 5g),然而將h5S-OT過表達后增加了兩者的結合(Fig。 5h)。體外剪接實驗也發現同時加入U2AF65 protein 和 h5S-OT RNA 比只加入其中一種對C1ORF43 外顯子的影響更明顯(Fig。 5i),表明h5S-OT 可招募U2AF65,需要U2AF65和Alu pairing來發揮其反式調控作用。 
 
 
7. 于h5S-OT來操控可變剪切的技術
 
將h5S-OT的Alu 序列替換成特定基因的反義序列,h5S-OT就可以干擾靶基因的剪切,這一結果顯示h5S-OT可作為一項生物技術來調控靶基因的可變剪切(Fig. 7a)。靶向基因的外顯子的上游內含子區域可增加相應外顯子的inclusion(Fig. 7b),靶向下游區域可減少外顯子的inclusion(Fig. 7c)。h5S-OT是一個內源性的lncRNA,可以翻譯調控可變剪切,招募剪切因子到mRNA前體。
 
 
參考文獻:Hu S, Wang X, Shan G. Insertion of an Alu element in a lncRNA leads to primate-specific modulation of alternative splicing[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2016, 23(11): 1011-1019.
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