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Dr. cell來啦!深入淺出解讀單細胞轉錄組測序技術路線
發布日期:2019-06-21瀏覽:

?hello,大家好。我是細胞博士。我有一個很洋氣的名字Dr. cell。經過多年的摸爬滾打、潛心鉆研,我終于學成歸來。很高興在這個莊嚴、隆重的場合閃亮登場。

多年圖書館沉浸式學習、實驗室不分日夜的操作實踐、生信分析代碼的鏖戰,我最最最富有的就是學習筆記、研究經驗。對于“單細胞研究”,我很自信。

當然,我是一個“大肚”的人,未來我會慢慢將我“單細胞研究”學習筆記傳授給大家。

第一次跟大家見面,我肯定不會空手而來。對細胞“博古通今”的我,先帶來一個重磅:單細胞研究最熱門的方向——單細胞轉錄組測序。看完下面我的筆記,我相信你肯定會對單細胞轉錄組測序的技術路線有一個成熟的把握。

 

單細胞研究您該知道的事~

人們對細胞的認識可以從1665年Robert Hooke發現細胞說起,科學家們對植物細胞和動物細胞展開了進一步的觀察研究,并由Schleiden和Schwann最早創立細胞學說,直到19世紀中期該學說才得以完善。從這些研究結論中我們認知到細胞是生物體結構和功能的基本單位,每個細胞有獨特的表型和生物學功能,細胞之間存在異質性,這也正是細胞作為生命科學研究的最基本單位的意義所在。

 

相同或不同組織、器官、系統中的細胞均存在異質性,這不僅體現在形態結構上,由于細胞的命運由遺傳物質決定,其本質差異更體現在基因組、轉錄組、表觀組等層面,因此可對不同組學展開單細胞研究,其優勢在于能夠避免Bulk樣本的均質化掩蓋單細胞的異質性,可以在單細胞水平深入探索健康生理和疾病異常下的細胞狀態,以了解生物體的功能機制和發現更為有效的疾病治療方法。

 

 

近幾十年來,人們一直圍繞單細胞進行研究,2013年,單細胞DNA測序和單細胞RNA測序曾被Nature Methods評為年度技術;2016年,大型國際合作項目“人類細胞圖譜計劃”(The Human Cell Atlas)啟動,該項目根據獨特的分子信息(如基因表達)對所有人類細胞種類進行定義,并將這些信息與傳統的細胞學表述(如位置和形態)相關聯,在全球掀起了單細胞研究的熱潮,尤其單細胞轉錄組測序是目前單細胞研究最熱門的方向。

 

 

 單細胞轉錄組測序



最早的單細胞組轉錄組技術只能檢測單個細胞中的少數基因,細胞和基因的通量都比較低[1],后來通過結合芯片技術使細胞和基因的通量有所提升[2,3],直到2009年湯富酬[4]將單細胞轉錄組與高通量測序結合時,基因檢測通量才大大提升,比芯片能檢測更多的轉錄本,這也是單細胞轉錄組測序的雛形,在此基礎上細胞分離技術和檢測技術等不斷得到提升改進,逐漸發展出現今比較成熟的技術。

單細胞轉錄組測序的技術路線大致為:

 

 

1.細胞分離

單細胞轉錄組研究面臨的一大技術難題是如何提升細胞通量,關鍵的技術突破是需要實現自動分離單細胞、從單個細胞中非定向擴增整個轉錄組、提升并行處理多個細胞的能力。從最初的人工手動分離如顯微吸取法、激光顯微切割法等,發展到自動化的集成流體電路、液滴微流控技術等,細胞通量從個位數跳躍到數萬個細胞的數量級。分離得到的單細胞需要進一步保證擁有各自獨立的微反應體系,比如微孔板利用孔間隔離、液滴微流控利用油滴包裹單細胞隔離。

 

 

 

2。單細胞標記

細胞標記是利用十多個堿基的核苷酸序列作為標簽(Barcode),在單細胞微反應體系的逆轉錄過程中進行標記,同一個細胞內的所有轉錄本標記上相同的Barcode,這樣在后續建庫時能夠混合操作,在數據分析層面也能夠達到區分單細胞表達譜數據的目的,如STRT-seq[5]、CEL-seq[6]等。隨著技術的升級,后來又引入了單細胞轉錄本UMI(Unique Molecular Identifier)標記,以解決PCR Bias對基因表達定量的影響,使基因定量更加精確,如CEL-seq2[7]、Drop-seq[8]。逆轉錄-標記之后得到cDNA鏈,進一步基于PCR或IVT技術對cDNA擴增以達到二代測序的要求。

 

 

3.基因檢測

對于檢測的基因類型,目前單細胞轉錄組測序是通過Poly(dT)捕獲攜帶Poly(A)的RNA分子,主要檢測mRNA和很少部分的lncRNA,檢測的基因區域范圍一般是3’ 端50-100 bp左右,對中高表達的基因較為敏感。與Smart-seq2相比,Smart-seq2雖然能夠檢測mRNA的全長信息、較多的基因數目,但是細胞通量低、成本較高,不適合大規模的單細胞研究。Smart-seq2與STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq等技術相比能夠檢測mRNA的全長信息,獲得較多的基因數目,但該技術仍存在細胞通量低、成本較高的缺點,不適合大規模的單細胞研究。

 

 

4。數據分析

高通量單細胞轉錄組測序在數據分析上有一定的套路可循:

 

當然,除此基本的分析套路之外還可以展開其他更為高級、個性的數據分析。 

綜上,在眾多研究者們的共同努力下,人們逐漸意識到研究單細胞的價值所在,形成了越發成熟的技術路線:從細胞分離→細胞標記→基因檢測→數據分析。

 

參考文獻

[1] Lambolez, B。 et al。 Neuron 9, 247–258 (1992)。 PMID: 1323310

[2] Tietjen, I。 et al。 Neuron 38, 161–175 (2003)。

[3] Kurimoto, K. et al. Nucleic Acids Res. 34, e42 (2006).

[4] Tang, F. et al. Nat. Methods 6, 377–382 (2009).

[5] Islam S. et al. Genome Res. 2011 Jul;21(7):1160-7.

[6] Hashimshony T。 et al。 Cell Rep。 2012 Sep 27;2(3):666-73。

[7] Hashimshony T. et al. Genome Biol. 2016 Apr 28;17:77. 

[8] Evan Z. et al. Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214.

我的筆記還算詳細吧。單細胞轉錄組測序的路線熟悉了嗎?歡迎大家讀完后與我探討。

 

 

Dr。 cell

2019-6-21

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